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Immun-Affinitätschromatographie
Aufreinigung von GFP-His via immobilisiertem aHis-CBD
Grün-fluoreszierendes Protein wurde rekombinant in Escherichia coli-Bakterien exprimiert. Um die Aufreinigung des rekombinaten Proteins zu vereinfachen, wurde seine Aminosäurensequenz um einige Histidin-Reste verlängert. Dieser sogenannte His-tag kann dazu verwendet werden, um ein rekombinantes Protein über eine Metall-Affinitätschromatographie zu reinigen. Allerdings enthält E.coli auch eigene Proteine, die an eine solche Affinitätsmatrix binden.
Um rekombinante Proteine trotzdem einfach und billig hochrein herzustellen, haben wir uns einen Trick einfallen lassen: Wir produzieren in einem zweiten E.coli-Stamm einen Teil eines gegen den His-tag gerichteten Antikörpers, der über einen Linker an ein Chitin-bindendes Protein gekoppelt ist. Den Extrakt aus diesen Bakterien lassen wir über eine mit Chitin-Perlen gefüllte Chromatographiesäule laufen - Durch das Chitin-bindende Protein bleibt der Antikörper auf der Säule hängen. Nun geben wir den Extrakt der Bakterien, die das Grün-fluoreszierende Protein produzieren, über die gleiche Säule. Das GFP wird über den His-tag vom Antikörper festgehalten, alle anderen, bakteriellen Proteine können wir aus der Säule herauswaschen.
Da die Bindung des His-tags an den Antikörper stark pH-abhängig ist, können wir nun durch eine einfache pH-Aenderung das GFP aus der Affinitätssäule herauslösen. In diesem Versuch begnügen wir uns mit der Immunaffinitätschromatographie. Wenn wir jedoch besonders reines Protein brauchen, können wir jedoch das GFP für einen weiteren Reinigungsschritt aus der Immunaffinitätssäule direkt auf eine Metall-Affinitätssäule laufen lassen.
Abkürzungen:
- IAC: Immun-Affinitäts-Chromatographie
- GFP: Green Fluorescent Protein
- aHis: Antikörper-Fragment, gerichtet gegen Histidin-tag
- CBD: Chitin bindende Domäne
- SPE: solid phase extraction
- SDS-PAGE: sodium dodecyl-phosphate polyacrylamide gel electrophoresis
Lösungen:
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MES-CB (pH 6.5): |
TBST-CB (pH 8.0): |
Elutionspuffer (pH 10): |
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20 mM Mes |
50mM Tris |
50mM Caps |
Praktisches Vorgehen:
- 10 ml-Säulen (Varian Bond Elut LRC) in den SPE-Prozessor stellen
- 1 ml Chitin-bead-Suspension (entspricht ca. 0.7 ml abgesetzte beads)
- Absetzen lassen
- Filter vorsichtig auflegen, waagrecht ausrichten
- Äquilibrieren mit 20 ml TBST
- 6 ml aHis-CBD (=1 g Zellen) lösl. Überstand in TBST-CB auftragen (ohne Druck)
- 2ml TBST (mit 0.2 bar Druck!)
- 7 ml MBS-CB (mit 0.2 bar Druck!)
- 3 ml GFP-His (= 2 g Zellen) lösl. Überstand (ohne Druck!)
- 25 ml MBS-CB (mit 0.2 bar Druck!)
- 2 ml Elutionspuffer pH 10
- erste 0.5 ml "Elution" verwerfen (evtl. nochmals 0.5ml), dann 2 x 1 ml sammeln
- je Fraktion 16 µl + 4 µl Auftragspuffer pro Spur im SDS-PAGE
- 2 µl GFP-His Rohextrakt A + 14 µl Elutionspuffer + 4 µl Auftragspuffer für SDS-PAGE
- Grössenmarker: 7 µl Prestained Marker + 9 µl Elutionspuffer + 4 µl Auftragspuffer für SDS-PAGE
- Proben ca. 5 min aufkochen im Heizblock
- Probenauftrag: Rohextrakt A-A1-A2-B1-B2-Marker-C1-C2-D1-D2-Marker
