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Messung der Pyruvatkonzentration mit Lactatdehydrogenase
Prinzip
Lactatdehydrogenase katalysiert folgende Reaktion:
Pyruvat + NADH + H+ <==> Lactat + NAD+
Unter den gewählten Bedingungen liegt das Gleichgewicht stark rechts, d.h. nach Zugabe des Enzyms werden Pyruvat und NADH nahezu vollständig in Lactat und NAD+ umgewandelt. Die Abnahme von im Überschuss vorhandenem NADH ist deshalb ein Mass für die Menge des vorhandenen Pyruvats.
Lösungen
- 3.75 mM NADH
- Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.6
- Substrat: Natriumpyruvat, unbekannte Konzentration
- ca. 100 µg/ml Lactatdehydrogenase
- Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.6
Ausführung
Die Komponenten in der unten angegebenen Reihenfolge und Menge in die Küvette pipettieren und mischen:
- NADH 0.1 ml
- Puffer 2.29 ml
- Substrat 0.1 ml
- Puffer 2.29 ml
Photometeranzeige ohne Küvette im Lichtweg auf E340 nm = 0.0 einstellen. Schreiber ebenfalls mit “Zero-Knopf” auf 0-Linie einstellen (rechte Grundlinie).
Testküvette in den Lichtweg stellen und Extinktion ablesen (=Anfangswert).
10 µl Enzymlösung auf Rührstäbchen pipettieren und Reaktion durch 3-maliges Eintauchen des Stäbchens in die Küvette auslösen.
Schreiber starten (Papiergeschwindigkeit 1 cm/Minute; der Skalabereich der Ordinate von 0 bis 100 entspricht einer Extinktion von 1.0) und die Extinktion gegen die Zeit aufzeichnen, bis die Extinktion konstant bleibt, d.h. für ca. 10-15 Minuten. Schreiber stoppen.
Extinktion ablesen (=Endwert). DE340 aus Anfangs- und Endwert bestimmen.
Berechnung der Pyruvatkonzentration
Aus deltaE340 die umgesetzte Pyruvat-Menge in der Messküvette berechnen (e340nm = 6220 M-1 cm-1), dann die millimolare Pyruvatkonzentration in der untersuchten Lösung berechnen und in mg/ml umrechnen (MW 88 D).
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mmol/l
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mg/ml
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| Pyruvatkonzentration: |
Fragen
- Welche Voraussetzungen müssen erfüllt sein, damit der optische Test zur Konzentrations-bestimmung von Substraten verwendet werden kann?
- In welcher Weise beeinflusst der pH-Wert das Gleichgewicht der Lactatdehydrogenase-Reaktion?
- Wie beeinflusst die zugegebene Enzymmenge den Verlauf der Kurve?
- Können Lactatkonzentrationen mit Hilfe dieser Reaktion bestimmt werden?
