Inhaltsübersicht | Nanomaschinen | Moleküle | Programme | Kurse | Fun | Links
Kontakt | Home	>

Bestimmung von Km und Vmax der sauren Phosphatase mit Inhibitor

Ansatz B: mit Inhibitor

Lösungen

• 3 mM Natriumvanadat (Na₃VO₄) in 0.2 M Na-Acetatpuffer pH 5.0
• Saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml)
• 30 mM p-Nitrophenylphosphat;
• 3 mM p-Nitrophenylphosphat;
• 0.5 mM p-Nitrophenylphosphat
• 0.25 M NaOH

Ausführung

Folgende Inkubationsansätze vorbereiten (ml):

	A	B	C	D	E	F	G	H	I
Natriumvanadat	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
Substrat, 30 mM	0.20	0.05	-	-	-	-	-	-	-
Substrat,  3 mM	-	-	0.20	0.15	0.10	0.05	-	-	-
Substrat, 0.5 mM	-	-	-	-	-	-	0.20	0.15	-
H2O	-	0.15	-	0.05	0.10	0.15	-	0.05	0.20

RG A bis I mischen und ins 37^oC-Wasserbad stellen. In einem weiteren RG ca. 2 ml der Enzymlösung ebenfalls ins 37^oC-Wasserbad stellen.

Nach 5 Min in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml der vorgewärmten Enzymlösung zu den Proben A - I geben.

Nach 15 Min bei 37^oC (d.h. 15 min nach der Zugabe von Enzym zu Probe A) 3.4 ml NaOH aus automatischer Pipette wiederum in genau 0.5-minütigen Abständen zu den Proben A - I geben.

Extinktionen bei 405 nm gegen Probe I (Kontrolle) ablesen und Werte in die Tabelle eintragen. Daraus die Konzentration des Produktes, [P], in den Inkubationsansätzen berechnen (Volumen = 0.6 ml). Der Extinktionskoeffizient des p-Nitrophenolat-Anions beträgt 18400 M^-1 cm^-1.

Last changed by: A.Honegger, 9/3/08