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pH-Abhängigkeit der sauren und alkalischen Phosphatase
Prinzip
Saure und alkalische Phosphatasen katalysieren beide die hydrolytische Spaltung von Phosphatestern, unterscheiden sich aber durch ihr pH-Optimum und den Mechanismus der Spaltung. Im folgenden Experiment wird die pH-Abhängigkeit der durch die beiden Enzyme katalysierten Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat verglichen. Der Phosphatester wird bei verschiedenen pH-Werten mit saurer bzw. alkalischer Phosphatase inkubiert. Die Reaktion wird am Ende der Inkubationszeit durch Zugabe von NaOH abgebrochen. Die enzymatische Aktivität wird durch photometrische Bestimmung des gebildeten p-Nitrophenol ermittelt.
Lösungen
- Saure Phosphatase (aus Kartoffeln, 30 µg/ml)
- Alkalische Phosphatase (aus Kälberdarm, 20 µg/ml)
- 10 mM p-Nitrophenylphosphat
- 0.25 M NaOH
- Pufferlösungen (0.1 M):
- pH 2, Glycin-HCl; pH 4 und pH 5, Essigsäure-Natriumacetat; pH 6, Histidin-HCl; pH 8, Tris-HCl; pH 10, Natriumbicarbonat-Natriumcarbonat; pH 12, Arginin-KOH.
- Alkalische Phosphatase (aus Kälberdarm, 20 µg/ml)
Ausführung
3 Reihen von je 6 RG für saure Phosphatase (A), alkalische Phosphatase (B) und Kontrolle (C) vorbereiten und nach folgendem Schema beschriften:
| Saure Phosphatase: |
A2
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A4
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A5
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A6
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A8
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A10
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A12
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| Alkalische Phosphatase: |
B2
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B4
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B5
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B6
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B8
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B10
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B12
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| Kontrolle: |
C2
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C4
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C5
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C6
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C8
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C10
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C12
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In jedes RG 0.2 ml Substrat (10 mM p-Nitrophenylphosphat) pipettieren. Je 0.2 ml der entsprechenden Pufferlösung (pH = Nummer des Gefässes) zugeben. Alle Röhrchen zum Vorwärmen ins 37oC-Wasserbad stellen. Daneben in 3 entsprechend markierten Röhrchen 2 ml saure Phosphatase, 2 ml alkalische Phosphatase sowie 2 ml destilliertes Wasser (für Kontrolle) ebenfalls vorwärmen.
Nach 5 Minuten der Reihe nach in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml vorgewärmte saure Phosphatase zu den Proben der Reihe A geben. Anfangszeit registrieren.
In gleicher Weise in 0.5-minütigen Abständen zu den Proben der Reihe B je 0.2 ml vorgewärmte alkalische Phosphatase und zu den Proben der Reihe C je 0.2 ml vorgewärmtes Wasser zugeben.
Jede Probe genau 15 Minuten ins 37oC -Wasserbad stellen. Reaktion durch Zugabe von 3.4 ml NaOH (mit automatischer Pipette) zu jedem RG in der gleichen Reihenfolge wie oben in genau 0.5-minütigen Abständen abbrechen.
Extinktionen aller Proben von Reihe A und B gegen C als Kontrolle bei 405 nm ablesen und in Tabelle eintragen. Resultate auf Millimeterpapier graphisch darstellen.
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pH 2 |
pH 4 |
pH 5 |
pH 6 |
pH 8 |
pH 10 |
pH 12 |
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Reihe A (saure Phosphatase) |
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Reihe B (alkalische Phosphatase) |
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.... |
.... |
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Reihe C (Kontrolle) |
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Aus der pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität erhält man Hinweise auf mögliche funktionelle Aminosäureseitenketten, die für die Enzymaktivität notwendig sind.
Fragen
- Welche Seitenketten könnten für die pH-Optima der beiden Phosphatasen verantwortlich sein?
- Welche Ladung tragen diese Seitenketten im aktiven Enzymmolekül?
