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Substratspezifität von Trypsin und Chymotrypsin
Chymotrypsin und Trypsin sind Endoproteasen. Für die katalytische Aktivität dieser Proteasen ist eine Serin-Aminosäure in der aktiven Tasche verantwortlich. Man bezeichnet diese Proteasen deshalb auch als Serin-Proteasen. Trypsin und Chymotrypsin haben aufgrund einer ähnlichen Aminosäuresequenz auch eine sehr ähnliche 3D-Struktur. Trotzdem bevorzugen beide Proteasen unterschiedliche Substrate. Während Trypsin bevorzugt die Hydrolyse von Peptidbindungen nach Lysin und Arginin katalysiert, katalysiert Chymotrypsin die Hydrolyse von Peptidbindungen nach grossen, hydrophoben Aminosäuren (Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin). Die unterschiedliche Substratspezifität kann anhand der dreidimensionalen Struktur erklärt werden: Die Seitenkette der Aminosäure nach welcher die Peptidbindung hydrolysiert wird, passt in eine Tasche des Enzymes (P1 Tasche). Bei Trypsin befindet sich am unteren Ende der Tasche die Seitenkette der Aminosäure Aspartat, d. h. eine negative Ladung. Bei Chymotrypsin wird die Tasche durch hydrophobe Seitenketten gebildet.
Prinzip
Proteasen können anstelle der Peptidbindung auch eine Esterbindung spalten. Die Spezifität von Trypsin und Chymotrypsin wird mit den beiden Substraten N-Benzoyl-L-argininethylester und N-Benzoyl-L-tyrosinethylester bestimmt. Die entstehende Carbonsäuren N-Benzoyl-L-arginin bzw. N-Benzoyl-L-tyrosin werden mit einem pH-Indikator nachgewiesen.
Lösungen
- 4 mM Tris-HCl pH 9.0 (Tris = Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, eine Puffersubstanz für den pH-Bereich 7 - 9)
- 8 mM N-Benzoyl-L-argininethylester in 50 % Methanol
- 8 mM N-Benzoyl-L-tyrosinethylester in 50 % Methanol
- Phenolrot als Indikator (sauer: gelb; alkalisch: rot; pKa = 7.9)
- 20 µg/ml Protease-Lösung I
- 20 µg/ml Protease-Lösung II
Ausführung
4 RG vorbereiten und folgende Komponenten zugeben:
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Ansätze |
A |
B |
C |
D |
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Tris-HCl |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
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Argininester |
1 ml |
- |
1 ml |
- |
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Tyrosinester |
- |
1 ml |
- |
1 ml |
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Proben müssen am Anfang rötlich gefärbt sein, andernfalls muss der Versuch mit frischer Tris-Lösung wiederholt werden. |
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Protease-Lösung I |
0.5 ml |
0.5 ml |
- |
- |
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Protease-Lösung II |
- |
- |
0.5 ml |
0.5 ml |
Inhalt gut mischen; RG ins 40oC-Wasserbad stellen und Farbänderungen beobachten. Farbe nach Ablauf von etwa 5 min feststellen und Ergebnisse in Tabelle eintragen.
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Protease I |
Protease II |
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Argininester |
(A) |
(C) |
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Tyrosinester |
(B) |
(D) |
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Protease I = |
Protease II = |
Fragen
- Welche Spezifitäten zeigen Trypsin und Chymotrypsin in vivo ?
- Was macht ein Enzym bezüglich Geschwindigkeit und Gleichgewicht einer Reaktion?
- Warum können Proteasen mehr oder weniger spezifisch sein?
- Welche anderen Protease Klassen kennen Sie?
- Wo kommen Proteasen ausser in der Verdauung vor?
